CHROMATOGRAPHIE DE PARTAGE Une goutte de l'échantillon est déposée sur une feuille d'un papier absorbant [Chromatographie sur papier - Thin Layer Chromatography (TLC)], ou sur une plaque de plastique ou de verre recouverte d'une mince couche d'un matériel absorbant inerte comme la cellulose ou un gel de silice [Chromatographie en couche mince (CCM)]. Le support idéal est l'Hydroxyapatite. On laisse ensuite un mélange de solvants, composé par exemple d'eau et d'un alcool, imprégner la feuille à partir d'un bord. En migrant à travers la feuille, le liquide sépare les molécules de l'échantillon selon leur solubilité relative dans les deux solvants. Les solvants sont choisis de telle façon que l'un d'eux soit adsorbé plus fortement que l'autre par le matériel absorbant et forme une couche de solvant immobile à la surface de la feuille. Dans chaque région de la feuille, les molécules s'équilibrent entre le solvant immobile et le solvant en migration. Plusieurs heures après, la feuille est séchée et colorée afin de repérer l'emplacement des différentes molécules. Chromatographie sur colonne On fait passer un mélange de protéines en solution à travers une colonne contenant une matrice poreuse. Les différentes protéines sont retardées à des degrés différents par leur interaction avec la matrice et peuvent être collectées séparément. Suivant le choix de la matrice, les protéines peuvent être séparées selon leur charge, leur hydrophobicité, leur taille, ou leur capacité à se fixer à des groupements chimiques particuliers. Chromatographie échangeuse d'ions La colonne est remplie de petites billes portant une charge soit positive, soit négative ; les protéines sont donc séparées en fonction de l'arrangement de leurs charges sur leur surface. Les matrices utilisées sont du DEAE-Cellulose ou du CM-Cellulose (Carboxy Methyl). Chromatographie par hydrophobicité La colonne contient des billes dont les chaînes latérales hydrophobes font saillie, ralentissant ainsi les protéines possédant des régions hydrophobes. Chromatographie par filtration sur gel La colonne est remplie de minuscules billes poreuses, ainsi les molécules suffisamment petites pour pénétrer dans les pores traînent à l'intérieur des billes au cours de leur déplacement, alors que les molécules plus volumineuses restent dans la solution circulant entre les billes et migrent donc plus rapidement, sortant les premières de la colonne. Cette technique, outre le fait de séparer les molécules, permet de déterminer leur taille. Chromatographie d'affinité Elle exploite les interactions de liaisons biologiques à la surface des protéines. On fabrique une colonne d'affinité, ainsi les protéines présentants une affinité avec le ligand vont se lier à la colonne (gel d'agarose) ; les autres protéines seront éluées. Des anticorps spécifiques peuvent être couplés à une matrice, de façon à purifier des molécules protéiques reconnues par les anticorps. Chromatographie d'exclusion. Par ce procédé on détermine le poids moléculaire de la protéine. Le volume d'élution est proportionnel au rayon de stokes pour les protéines non sphériques. On utilise un gel d'agarose ou de séphadex. Chromatographie en Phase Gazeuse (CPG) Les molécules volatiles sont séparées les unes des autres par partage différentiel entre une phase gazeuse mobile et une phase stationnaire liquide ou solide. La phase stationnaire est emprisonnée dans une colonne ou fixée sur un support, et la phase mobile se déplace au contact de celle-ci. L'entraînement des composés présents dans la phase mobile à des vitesses différentes conduit à leur séparation. L'appareil de CPG se compose d'un injecteur, d'une colonne et d'un détecteur placés dans une enceinte thermostatée à haute température. La phase mobile, qui entraîne l'échantillon dans la colonne, est un gaz vecteur qui peut être de l'azote, de l'hélium ou de l'hydrogène. L'échantillon est introduit sous forme liquide ou gazeuse dans l'injecteur. Celui-ci a pour rôle de porter cet échantillon ) l'état de vapeur, puis de le mener dans le flux gazeux en tête de la colonne. La colonne est un tube enroulé sur lui-même et renfermant la phase stationnaire. La phase gazeuse, en sortie de la colonne, passe par un détecteur avant de sortir à l'air libre. L'analyse par chromatographie d'un composé aboutit à l'obtention d'un chromatogramme. C'est un diagramme à deux dimensions montrant l'évolution en fonction du temps d'un paramètre qui dépend de la concentration instantanée du soluté en sortie de colonne. Le temps d'élution est en abscisse et le signal du détecteur en ordonnée. La séparation produite par la colonne conduit à une série de pics plus ou moins isolés les uns des autres. Remarque : l'analyse de composés liquides ou solides par CPG impose de pouvoir les porter à l'état de vapeur par chauffage. Cette technique limite donc son emploi aux composés moléculaires thermostables et volatils. Colonnes de chromatographie liquide à haute performance (HPLC : High Performance Liquid Chromatography) Elles sont utilisées pour atteindre un pouvoir de résolution très élevé. Du fait qu'elles contiennent des particules (3 à 10 µm de diamètre) très fortement compressées, les colonnes HPLC ont des vitesses d'écoulement négligeables à moins de leur appliquer de fortes pressions. Ainsi, ces colonnes sont coulées dans des cylindres d'acier et nécessitent un système élaboré de pompes et de valves afin que le solvant les traverse à une pression suffisante pour que les vitesses d'écoulement aient la rapidité désirée. Les solutés s'équilibrent très rapidement avec l'intérieur des sphères minuscules; les fractionnements sont donc effectués en quelques minutes contrairement aux techniques de chromatographie traditionnelles qui prennent des heures. ELECTROPHORESE Les protéines ont une charge nette positive ou négative reflétant le mélange d'acides aminés dont elles sont formées. Si l'on applique un champ électrique à une solution contenant une molécule protéique, celle-ci migrera à une vitesse qui dépend de sa charge nette, de sa taille et de sa forme. Technique utilisée soit en solution aqueuse, soit dans des solutions retenues dans une matrice poreuse solide comme l'amidon.   Electrophorèse sur gel de polyacrylamide-SDS (SDS-PAGE) Technique utilisant un gel de polyacrylamide fortement réticulé à travers lequel les protéines migrent. La taille des pores du gel peut-être ajustée de façon à ce qu'elle soit assez petite pour retarder la migration des molécules protéiques voulues. Les protéines sont dans une solution contenant un détergent puissant, chargé négativement : le SDS (Sodium Dodécyl Sulfate). Du fait que le détergent se lie aux régions hydrophobes de la molécule protéique, provoquant leur déroulement en chaînes polypeptidiques allongées, les molécules protéiques sont libérées de leurs associations avec d'autres molécules protéiques ou lipidiques, et rendu aisément solubles dans la solution du détergent. (ajout de Mercaptoéthanol pour rompre les ponts S-S). Chaque protéine fixe un grand nombre de molécules de détergent chargées négativement (masquant la charge de la protéine), et provoque sa migration vers l'électrode positive lorsqu'on applique une tension. Les protéines de même taille tendent à se comporter de façon identique tandis que les protéines de plus grande taille (avec un plus grand nombre de charges négatives) seront soumisent à de plus grandes forces électriques et aussi à une plus forte accélération. Un mélange complexe de protéines est donc fractionné en une série de bandes protéiques disposées par ordre de poids moléculaire.   Pour l'ADN, le SDS est inutile car les nucléotides portent déjà une charge négative unique. Pour des fragments d'ADN de longueur inférieure à 500 nucléotides, des gels de polyacrylamide permettent de séparer deux molécules qui ne diffèrent que d'un seul nucléotide. Cependant les pores du gel sont trop petits pour permettre le passage de molécules d'ADN de plus grande taille; pour les séparer selon leur taille on utilise des gels plus poreux formés par des solutions diluées d'agarose. Les bandes d'ADN sur gel de polyacrylamide et d'agarose seront invisibles si l'ADN n'est pas marqué ou coloré. Une méthode sensible de coloration de l'ADN consiste à plonger le gel après électrophorèse dans le Bromure d'Ethidium qui fluoresce en lumière UV lorsqu'il est lié à l'ADN.   Electrophorèse bidimensionnelle sur gel de polyacrylamide Les méthodes de séparation unidimensionnelle (SDS-PAGE ou chromatographie) ne peuvent résoudre qu'une 50aine de protéines car les bandes ou les pics protéiques très proches se chevauchent. On utilise donc l'électrophorèse bidimensionnelle sur gel qui combine deux modes de séparation différents et qui permet de séparer plus de 1000 protéines différentes sous la forme d'une carte protéique bidimensionnelle. L'échantillon est dissous dans une solution contenant un détergent non ionique (non chargé), du mercaptoéthanol et un agent dénaturent l'urée. Cette solution solubilise, dénature et dissocie toutes les chaînes polypeptidiques sans modifier leur charge intrinsèque. Les chaînes polypeptidiques sont ensuite fractionnées par une focalisation isoélectrique, qui repose sur le fait que la charge nette d'une protéine varie avec le ph de la solution environnante. Dans la focalisation isoélectrique, l'électrophorèse des protéines se fait dans un tube étroit de gel de polyacrylamide où un gradient de ph est établi. Chaque protéine migre vers la position du gradient correspondant à son point isoélectrique et s'y immobilise. Dans la seconde étape, le gel étroit contenant les protéines séparées est à nouveau soumis à une électrophorèse, mais dans une direction perpendiculaire à celle utilisée précedemment. On plonge le gel étroit contenant les protéines dans du SDS, puis on le place au bord d'un bloc de gel de polyacrylamide-SDS, à travers lequel chaque chaîne polypeptidique migre pour former une tache séparée (séparation selon la taille). C'est la seconde dimension de l'électrophorèse bidimensionnel sur gel. On sépare ainsi les protéines selon leur taille et leur point isoélectrique (Il est très rare de trouver deux protéines identiques). Révélation de l'échantillon par autoradiographie (marquage au phosphore 32, carbone 14, thymidine tritiée).