ELECTROPHORESE
Les protéines ont une charge nette positive ou négative reflétant le mélange d'acides aminés dont elles sont formées. Si l'on applique un champ électrique à une solution contenant une molécule protéique, celle-ci migrera à une vitesse qui dépend de sa charge nette, de sa taille et de sa forme.
Technique utilisée soit en solution aqueuse, soit dans des solutions retenues dans une matrice poreuse solide comme l'amidon.
Electrophorèse sur gel de polyacrylamide-SDS (SDS-PAGE)
Technique utilisant un gel de polyacrylamide fortement réticulé à travers lequel les protéines migrent. La taille des pores du gel peut-être ajustée de façon à ce qu'elle soit assez petite pour retarder la migration des molécules protéiques voulues.
Les protéines sont dans une solution contenant un détergent puissant, chargé négativement : le SDS (Sodium Dodécyl Sulfate).
Du fait que le détergent se lie aux régions hydrophobes de la molécule protéique, provoquant leur déroulement en chaînes polypeptidiques allongées, les molécules protéiques sont libérées de leurs associations avec d'autres molécules protéiques ou lipidiques, et rendu aisément solubles dans la solution du détergent. (ajout de
Mercaptoéthanol pour rompre les ponts S-S).
Chaque protéine fixe un grand nombre de molécules de détergent chargées négativement (masquant la charge de la protéine), et provoque sa migration vers l'électrode positive lorsqu'on applique une tension. Les protéines de même taille tendent à se comporter de façon identique tandis que les protéines de plus grande taille (avec un plus grand nombre de charges négatives) seront soumisent à de plus grandes forces électriques et aussi à une plus forte accélération.
Un mélange complexe de protéines est donc fractionné en une série de bandes protéiques disposées par ordre de poids moléculaire.
Pour l'ADN, le SDS est inutile car les nucléotides portent déjà une charge négative unique. Pour des fragments d'ADN de longueur inférieure à 500 nucléotides, des gels de polyacrylamide permettent de séparer deux molécules qui ne diffèrent que d'un seul nucléotide.
Cependant les pores du gel sont trop petits pour permettre le passage de molécules d'ADN de plus grande taille; pour les séparer selon leur taille on utilise des gels plus poreux formés par des solutions diluées d'agarose.
Les bandes d'ADN sur gel de polyacrylamide et d'agarose seront invisibles si l'ADN n'est pas marqué ou coloré. Une méthode sensible de coloration de l'ADN consiste à plonger le gel après électrophorèse dans le Bromure d'Ethidium qui fluoresce en lumière UV lorsqu'il est lié à l'ADN.
Electrophorèse bidimensionnelle sur gel de polyacrylamide
Les méthodes de séparation unidimensionnelle (SDS-PAGE ou chromatographie) ne peuvent résoudre qu'une 50aine de protéines car les bandes ou les pics protéiques très proches se chevauchent. On utilise donc l'électrophorèse bidimensionnelle sur gel qui combine deux modes de séparation différents et qui permet de séparer plus de 1000 protéines différentes sous la forme d'une carte protéique bidimensionnelle.
L'échantillon est dissous dans une solution contenant un détergent non ionique (non chargé), du mercaptoéthanol et un agent dénaturent l'urée. Cette solution solubilise, dénature et dissocie toutes les chaînes polypeptidiques sans modifier leur charge intrinsèque.
Les chaînes polypeptidiques sont ensuite fractionnées par une focalisation isoélectrique, qui repose sur le fait que la charge nette d'une protéine varie avec le ph de la solution environnante. Dans la focalisation isoélectrique, l'électrophorèse des protéines se fait dans un tube étroit de gel de polyacrylamide où un gradient de ph est établi. Chaque protéine migre vers la position du gradient correspondant à son point isoélectrique et s'y immobilise.
Dans la seconde étape, le gel étroit contenant les protéines séparées est à nouveau soumis à une électrophorèse, mais dans une direction perpendiculaire à celle utilisée précedemment. On plonge le gel étroit contenant les protéines dans du SDS, puis on le place au bord d'un bloc de gel de polyacrylamide-SDS, à travers lequel chaque chaîne polypeptidique migre pour former une tache séparée (séparation selon la taille). C'est la seconde dimension de l'électrophorèse bidimensionnel sur gel.
On sépare ainsi les protéines selon leur taille et leur point isoélectrique (Il est très rare de trouver deux protéines identiques).
Révélation de l'échantillon par autoradiographie (marquage au phosphore 32, carbone 14, thymidine tritiée).
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